产品货号：
BTN7-240113
中文名称：
木瓜样蛋白酶活性测定试剂盒
英文名称：
Papain-Like Protease Activity Assay Kit
产品规格：
100T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是荧光法测定木瓜样蛋白酶（Papain-like protease，PLpro，EC 3.4.19.12）活性的试剂盒。试剂盒采用含LXGG序列的荧光标记多肽为底物，它被酶切后可在360nm激发产生460nm荧光，通过测定荧光值即可测定PLpro活性。
该酶选择性地识别并切割病毒多蛋白链的LXGG位点并参与复制酶的生成，它也催化蛋白脱泛素过程，在SARS-CoV-1和-2等冠状病毒成熟和致病机制中起着重要作用，因此快速检测其酶活具有重要的意义。为此本公司开发了基于荧光光度法的PLpro活性检测试剂盒。
- 即开即用，用户不需要单独购买并优化每个成分。
- 使用便捷，整个实验可以在2小时内完成。
- 96孔板模式，尤其适合高通量检测。不适合比色皿检测。
- 可用于含重组或天然PLPro酶的样本。
- 提供重组的SARS-CoV-2 PLpro和荧光标准品。
- 本制品足够100次96孔板测定实验，每次40μL反应体系。
- 一个木瓜样蛋白酶活性单位的定义为37℃温度下每分钟释放1pmol荧光物质的酶量。
- 本制品只可用于科研。
| 组分 | 规格 | 保存 |
| PLpro荧光底物液 | 2mL | -80℃ |
| 5ng/μL重组SARS-CoV-2 PLpro酶液 | 50μL | |
| 2×PLpro反应液 | 25mL | -20℃ |
| 5μM荧光标准品溶液 | 100μL | |
| DTT | 77mg |
保存：按标签指示条件保存，有效期6个月。
待测样品，超纯水，DMSO，96孔板（跟所用的荧光光度计兼容），可测340nm激发光/460nm发射光的荧光光度计。
一、准备工作
- 首次使用本试剂盒时，在DTT管中加入1mL自备超纯水，颠倒20次混匀后加20μL到PLpro荧光底物液中，加500μL到2×PLpro反应液中，轻柔颠倒20次混匀后待用。没用完时上述溶液均存-20℃。
二、配制至少6个稀释度的荧光标准品
- 配制1mL 1×PLpro反应液：在1个1.5mL离心管中加入0.5mL 2×PLpro反应液和0.5mL自备超纯水，涡旋1分钟混匀，常温放置待用。
- 标记7个1.5mL离心管，分别为0、1、2、3、4、5、6。
- 在每管中加入50μL 1×PLpro反应液。盖上0号管作为对照。
- 在6号管中加入50μL 5μM的荧光标准品溶液（试剂盒提供），涡旋1分钟混匀，得2.5μM的荧光标准品稀释液。常温放置待用。
- 换枪头，在5号管中加入50μL 2.5μM荧光标准品稀释液（上步稀释所得），涡旋1分钟混匀，得1.25μM荧光标准品稀释液。常温放置待用。
- 换枪头，在4号管中加入50μL 1.25μM荧光标准品稀释液（上步稀释所得），涡旋1分钟混匀，得0.625μM荧光标准品稀释液。常温放置待用。
- 重复上面的操作，直到在1～6号管中得到2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078μM共6个荧光标准品稀释液，加上0号管共7个样本。常温放置待用。此溶液每次需新鲜配制。
三、待测PLpro样本的制备
- 细胞培养上清液样本：收集培养细胞的上清，4℃ 1000×g离心10分钟，收集上清，取少量按1∶1的比例跟2×PLpro反应液混合，放冰上待用。未用完的存-80℃。
- 细胞裂解液样本：4℃ 500×g离心10分钟收集细胞，加入适量自备的细胞裂解液（建议使用CHAP细胞裂解液）到细胞沉淀中，重悬细胞，冰上放置10分钟裂解细胞，用枪头吹打5次，将裂解液全部转移到1.5mL离心管中，4℃ 10000×g离心5分钟，取少量按1∶1的比例跟2×PLpro反应液混合，测定蛋白浓度，待用。未用完的存-80℃。
四、PLpro酶切反应设置
- 如有N个待测样本，每个做1次重复，则反应数为N+8，其中N个用于待测样本，1个用于空白对照，1个用于PLpro阳性对照，6个用于标曲样本。如每个样本做重复，则反应数应相应地变动。以下按1个样做1次重复示例。
- 在96孔板的各反应孔中按下表顺序加入各成分，反应总体积为40μL。
成分 空白
对照孔阳性
对照孔N+2个
待测样品孔标曲样品孔
（0～6管）1×PLpro反应液 20μL - - - 5ng/μL PLpro酶液 - 20μL - - N+2个待测样本 - - 各20μL - 7个标准品稀释液 - - - 各40μL PLpro荧光底物 20μL 20μL 20μL - - 摇晃30秒混合均匀，放37℃保温，每5分钟在340nm激发光/460nm发射光条件下记录一次荧光值，共30分钟。
五、数据分析
- 从所有数据中减去空白对照值，然后进行下面的计算。
- 制作标准曲线求转换系数：6～0号标准品的浓度分别为2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0μM，反应体积为40μL，故换算成绝对量分别为100、50、25、12.5、6.25、3.13、0pmol，以其为横轴，以测出的荧光值为纵轴，得到标曲方程式。R2应大于0.95（如果不是线性，需要跟厂家联系），其斜率即为转换系数。
- 计算每个样本的斜率：以时间为横轴，以每个样本的荧光值为纵轴，得每个样本的线性区域（一般在前5～15分钟），然后计算出线性区斜率（速度）。
- 计算每个样本酶活性单位数：本试剂盒一个木瓜样蛋白酶活性单位的定义为在37℃温度下每分钟释放1pmol荧光物质的酶量，故40μL体系中PLpro酶活性单位数=线性区斜率÷转换系数。
- 由于40μL反应孔中加入的样本体积是20μL，上步得到的酶单位数相当于20μL待测样本的酶单位数，根据第9步或第10步计算出的蛋白浓度，可计算出20μL样本中蛋白的μg数，则酶的比活=20μL样本中的酶单位数/20μL样本中的蛋白μg数。
- 本试剂盒提供的重组SARS-CoV-2PLpro酶液酶活性为71.85U/mL，故比活为14.37U/μg，如果所测结果跟此数字不同，请跟厂家联系，找到原因后再继续。
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